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 T7体外转录试剂盒

     本试剂盒是基于T7 RNA聚合酶的RNA体外转录试剂盒,它利用含有T7启动子的模版DNA,以四种NTP为底物,从T7启动子下游开始合成与模版DNA中一条链互补的RNA,简单快速获得大量的RNA分子。


本产品具有下列特点:

● 即开即用,用户只需提供含T7启动子的DNA模板即可以进行体外转录实验,不需要单独准备每一个成份。

● 进行体外转录合成RNA时,本试剂盒不仅适用于含有T7 Promoter的线型Plasmid,也适用于带有T7 Promoter序列的PCR产物及Oligo DNA等。

● 可以合成的RNA的最佳长度在20nt到2000 nt之间。

● 产品配方经过精心优化,试剂盒中附带有Control Template,以20 ng的Control Template为模板,在20 μL的转录反应体系中,可以合成约10 μg的1 kb单链RNA。

● 得到的RNA可以用于RNA 结构研究、核酶生物化学、体外翻译、RNA-蛋白质相互作用、反义技术、SELEX 技术和 RNA 干扰(RNAi)等实验。

规格及成分:

成份

规格

转录缓冲液(10×)

200uL

阳性对照DNA
(1 KB PCR片段)

10uL(60ng/uL)

T7 RNA聚合酶

40 uL

RNase-free 水

1 mL

rNTP Mix
(25mM each)

150uL

DEPC管

10个

使用手册

1份


运输及保存

●  低温运输,-20℃保存、有效期一年。

相关资料

一、制备DNA模板

       PCR片段和质粒DNA都可以用作体外转录的模板,但是必须注意以下几点。一是必须使用线性化的DNA。如果是质粒DNA,则必须先用适当的限制性内切酶切成线状。二是需要转录的DNA序列的上游必须有T7启动子。如果模板是PCR产物,则可以在设计引物时将T7启动子序列(5’TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG 3’)加上。如果是将DNA片段克隆到载体上,则需要选择有T7启动子的载体,并且克隆位点必须位于T7启动子下游。三是需要转录的DNA序列的下游端最好不要是3’突出。如果是3’突出(比如选择了Pst I来线性化质粒),则最好用T4 DNA聚合酶修平。四是必须保证DNA模板中没有RNase。由于提取质粒DNA的过程中一般要使用大量的RNase A,因此质粒DNA一般都有严重的RNase A污染,所以在用作模板前,最好采取胶回收得方法回收质粒DNA。并且加入少量总RNA一起保温,然后电泳检测RNA是否被降解,以此来判断纯化的DNA模板是否有残留RNase A。


二、体外转录

        1. 在一个RNase-free 的塑料离心管中,在室温下(不是在4℃下)按次序加入下列成分:

成份

加入量

备注

RNase-free水

(13-x)ul

先根据模板DNA浓度确定模板量

转录反应缓冲液,
10X

2uL

 

DNA模板

X uL

总量在50ng-1ug(如果模板是PCR片段,建议用50ng左右;如果模板是质粒DNA,建议用1 ug左右;如果用本产品提供的阳性对照,建议用1uL)

dNTP(Mix)

4uL

 



        2. 用封口膜包好管口,60℃水浴30min,使反应体系中的RNase抑制物充分发挥作用,以去除模板中的RNase。

        3. 待反应体系冷却后加入1ul T7 RNA 聚合酶,37℃保温2小时。注意:延长保温时间不能明显提高产量。
          (注:此为20uL反应体系的用量,对其他反应体系,各成分的用量可以按比例增减。)

        4. 70℃加热10分钟灭活T7 RNA聚合酶。

        5. 取1-3uL电泳检测转录效果。

        6. 得到的RNA可以放-80℃保存。


三、去除DNA模板

       1. 在体外转录体系中加入1 uL自备的 RNase-free DNase (3-5U/uL)。

       2. 37℃保温15-30分钟。

       3. 补水到100 uL。

       4. 用等体积的Tris饱和酚-氯仿抽提一次。

       5. 加0.1 倍体积的3M NaAc和2倍体积的乙醇,混匀后最高转速离心15-30分钟,弃上清后加入1mL 70%的乙醇,振荡后最高转速离心2分钟,弃上清,晾干,所得沉淀即体外转录所得的RNA。


疑难解答

1、没有RNA产物。最常见原因是模板有RNase污染,可用纯化的RNA跟模板DNA一起保温,再检测RNA是否降解。还可以增加RNase Inhibitor用量,本试剂盒缓冲液和酶混业液中有RNase inhibitor,如果模板RNase污染严重,可能需要用户补加RNase inhibitor。

2、RNA产量低。最常见的原因是DNA模板。在转录序列的第一个和第二个碱基最好都是G,在前14个碱基内
避免有U存在。

3、RNA长度比预期的短。可能是模板序列中有T7 RNA聚合酶的终止序列。

4、RNA长度比预计的长。T7 RNA聚合酶跟Taq DNA聚合酶一样,有不依赖于模板的加尾功能,最多有一半的RNA可以带一个或两个碱基的尾巴。如果RNA长度比预计的长很多,使用的模板又是质粒DNA,则可能是质粒DNA线性化不彻底。

5、5’单磷酸还是三磷酸。如果使用GTP,则得到的RNA是三磷酸,体外转录时如果保温时间太长(如12小时),则有50%的三磷酸会变成单磷酸。如果在转录体系中加入GMP,则T7 RNA聚合酶将优先使用GMP,所得RNA产物中5’端是单磷酸的比例将大大增加。

 

 

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