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 原核蛋白表达与纯化

    技术服务按步骤收费,客户可以选择从以下任意一步开始提供服务或仅选择其中的单独一步。由于客户对于蛋白表达、纯化服务的具体要求差异较大,您可以将您的服务要求填写到蛋白纯化服务订单表格中,请尽量详细、准确填写,充分的沟通将有助于我们为您提供更好、更快的服务。

步骤1. 获取目标基因DNA序列
◆从基因库中搜索目标蛋白的cDNA序列;
◆根据选定的表达系统对cDNA进行密码子优化;
◆合成设计好的基因序列或通过基因克隆的方式获得基因序列。
提供客户:目的基因(在T载体或常规穿梭载体上)及测序报告。

步骤2. 表达载体构建
◆将目标基因亚克隆到合适的表达质粒上并测序验证构建质粒的准确性
◆可提供的表达载体如下(若需特殊的表达载体或启动子序列,需由客户提供):

大肠杆菌表达体系载体

Expression Vector

Promoter

载体所含Tag

pET3a, pET11a, pET24a

T7/ac

None or T7 Tag

pET32a

T7/ac

TRX & HIS

pET41a

T7/ac

GST & HIS

pET22b, pET25b, pET26b

T7/ac

Secret/分泌表达

pET28a, pET15b, pRSETb

T7/ac

HIS

pET50b, pET43a

T7/ac

Nus, HIS

pPEPTIDE

T7/ac

HIS

pMAL-c2x

T7/ac

MBP

pGEX4T, pGEX5X, pGEX6P

T7/ac

GST

pQE30

T5

HIS

pTrcHisB

Trc

T7, HIS

pTWIN

T7/ac

Intein, CBD

pBV220

PRPL

None

提供客户:正确构建的重组表达质粒,含重组质粒的DH5α菌株及测序报告。

步骤3. E. coli 表达菌株转化及筛选
◆将表达质粒转化到高效的E. coli表达菌株中,至少挑选5个阳性克隆进行诱导表达目标蛋白;
◆SDS-PAGE电泳检测目标蛋白的表达情况,从中挑选合适的单克隆菌株用于目标蛋白的表达。
◆可提供表达菌株:BL21(DE3), BL21(DE3)Lys,BL21-CodonPlus, Rosetta-gami。
提供客户:重组质粒的表达菌株及表达检测报告。

步骤4. 目标蛋白表达及纯化
◆摇瓶培养重组细菌,诱导表达目标蛋白;
◆亲和,离子交换,疏水层析等多种层析方法纯化表达的重组蛋白;
◆SDS-PAGE电泳检测每步结果控制最终产品质量;
◆Western-blot验证目标蛋白正确性。
提供客户:纯化好的目标蛋白3~10mg及纯化报告。可按客户要求提供含纯化标签(Tag)或切除纯化标签(Tag)的最终蛋白,纯度最高可达90%以上。

步骤5. 目标蛋白的再加工及详细检测
◆对生物学活性要求较高的纯化后蛋白产品进行复性研究:利用多达20种不同复性缓冲液的体系,对目标蛋白进行小量复性试验提供复性后样品供客户检测。可根据客户要求,按照其中一种样品的复性条件制备小量的复性蛋白。可提供具体的复性缓冲液配方及复性工艺。
◆除内毒素,除菌,冻干等进一步加工;
◆通过HPLC,质谱等方法详细检测目标蛋白的质量。
提供客户:加工后的终产品及相关实验和检测报告。

步骤6. 大规模制备
按照小试工艺放大生产规模,制备客户需要的合格蛋白产品。

提供客户:合格的目标蛋白及服务报告。

 

 

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