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 酵母蛋白表达与纯化

    技术服务按步骤收费,客户可以选择从以下任意一步开始提供服务或仅选择其中的单独一步。由于客户对于蛋白表达、纯化服务的具体要求差异较大,您可以将您的服务要求填写到蛋白纯化服务订单表格中,请尽量详细、准确填写,充分的沟通将有助于我们为您提供更好、更快的服务。

步骤1. 目标基因全基因合成
◆从基因库中搜索目标蛋白的cDNA序列。
◆根据选用的表达系统对cDNA进行密码子优化。
◆合成设计好的基因序列。
提供客户: 目标基因(在T载体或常规穿梭载体上)及测序报告。


步骤2. 目标基因亚克隆
◆将目标基因亚克隆到合适的表达质粒上,并测序验证构建质粒的准确性。
可提供表达载体:pPICZα和pPIC9K。
提供客户: 正确构建的重组表达质粒,含重组质粒的DH5α菌株及测序报告。
 

步骤3. P. Pichia表达菌株电转化
◆酶切线性化表达质粒后,将表达质粒通过电转化到高效的P. Pichia表达菌株中;
◆通过PCR鉴定至少挑选5个阳性克隆。
◆可提供表达菌株:X33,GS115,KM71和SMD1168。
提供客户: PCR阳性克隆及PCR结果报告。


步骤4. P. Pichia表达菌株筛选
◆将5个阳性克隆于BMGY培养基中扩增,然后换至BMMY培养基中,并加入甲醇诱导表达目标蛋白;
◆SDS-PAGE电泳检测培养上清中目标蛋白的表达情况,并挑选合适的单克隆菌株用于目标蛋白的表达;
提供客户: 任意一个客户需要的阳性克隆菌株及表达筛选结果报告。
 

步骤5. P. Pichia表达菌株表达优化
◆挑选20个阳性克隆进行常规表达筛选,并对其中表达最好菌株优化表达条件;
◆对挑选出来的单克隆菌株,优化培养及诱导条件(培养基,菌体密度,甲醇浓度,诱导时间等),提高目标蛋白的表达量。
提供客户: 任意三个客户需要的阳性克隆菌株及优化表达条件结果报告。


步骤6. 目标蛋白表达及纯化
◆摇瓶培养重组酵母菌,诱导表达目标蛋白;
◆通过亲和,离子交换,疏水及凝胶过滤等多种层析方法纯化表达的重组蛋白;
◆SDS-PAGE电泳检测每步结果并控制最终产品质量;
◆Western-blot法验证目标蛋白正确性。
提供客户:纯化好的目标蛋白1~10mg及纯化报告。可按客户要求提供含纯化标签(Tag)或切除纯化标签(Tag)的最终蛋白,纯度最高可达90%以上。
 

步骤7. 目标蛋白的再加工及详细检测
◆对生物学活性要求较高的纯化后蛋白产品进行复性研究;
◆除内毒素,除菌,冻干等进一步加工;
◆通过HPLC,质谱等方法详细检测目标蛋白的质量。
提供客户:加工后的终产品及相关实验和检测报告。


步骤8. 大规模制备
按照小试工艺放大生产规模,制备客户需要的合格蛋白产品。
提供客户:合格的目标蛋白及服务报告。

 

 

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