服务热线:4008-513-777
用户名
密   码
  登陆 注册
     

 sgRNA活性检测

  我公司提供多种sgRNA活性检测方法,包括SSA luciferase报告系统、Surveyor法、Q-PCR、突变点基因测序等。

•   SSA检测:根据客户要求检测sgRNA的活性及敲除效率,客户也可以选购我公司Precut pSG-target Cloning kit自行构建报告载体用于检测,我公司提供阳性及阴性sgRNA及其SSA report target质粒。
•   检测原理:SSA报告质粒(pSG-target)中luciferase基因被终止密码子提前终止,这种截短的luciferase没有活性。为检测sgRNA的剪切活性,将Cas9/sgRNA的靶点序列插入到终止密码子之后。在Cas9和sgRNA的作用下,靶点位置的序列被有效剪切形成DSB,细胞通过同源重组重新形成有活性的luciferase(Figure 2),通过检测luciferase的活性升高就可以反应Cas9/sgRNA的剪切活性(Figure 3)。



Figure 2. Restore disrupted luciferase function via sgRNA-mediated homologous recombination


Figure 3.Increased FL/RL ratio in Cas9/sgRNA transfection cells.

 Surveyor法及测序验证:
    CRISPR/Cas9打靶基因后引入的突变的方式与ZFN、TALEN基本一致,都是NHEJ或是HR。因此在CRISPR/Cas9的应用中,活性检测或是突变效率的检测可以参照ZFN和TALEN方法.主要包括有:靶位点直接PCR后TA克隆测序和基于可以识别错配双链的错配内切酶检测法(Surveyor法)。
    Surveyor法即错配酶法:靶序列经CAS/sgRNA切割后由于缺乏修复模板,将主要以非同源重组的方式进行修复,或多或少会插入或删除一些碱基。因此将靶序列PCR扩增后经变性、退火,将形成错配。错配酶(主要是CEL1或T7E1酶)将识别错配的杂合双链并剪切。产物跑电泳,比较切割条带与未切割条带的比例,即可反映出Cas/sgRNA的活性。



相关产品:

    1、Precut pSG-Target Cloning Kit & SSA Assay
    2、pSG-n-gRNA(negative control)
    3、pSG-p-gRNA(positive control)
    4、pSSA-luc target

 

 

电话:

4008-513-777、0513-85175205、85175207

E-mail :

jane@biomics.cn      order@biomics.cn

在线联系:

在线联系在线联系      在线联系在线联系